Экспериментальная работа по пересадке аллогенных кератиноцитов на искусственно созданные рубцы белых крыс

Желание использовать клеточный потенциал и необходимость поиска новых эффективных методов улучшения эстетического вида рубцов привели к идее попытаться изучить возможность пересадки кератиноцитов на рубцовые поверхности.

Для того, чтобы доказать вероятность использования культуры кератиноцитов для улучшения вида рубцов была проделана экспериментальная работа на белых лабораторных крысах, которым создавались рубцовые поверхности. Модель рубцов крыс получали в результате заживления искусственно нанесенных ран на спине, вдоль позвоночника. Крысам вырезались одинаковые куски кожи, размером 2x3 см. Через 2,5 месяца после операции "моделирования рубцов", крысам была проведена операция дермабразии (снятия верхних слоев рубца с помощью термокаустики) и пересажены аллогенные кератиноциты, выделенные из кожи крысят на 2-4 сутки после рождения.

Выделение и выращивание крысиных эпидермоцитов осуществлялось в лаборатории клеточных технологий Института Цитологии РАН последующей технологии.

Кожу промывали в солевом растворе Хенкса, содержащем 200 U/ml гентамицина, разрезали на мелкие кусочки, площадью 0,2-0,5 см². Кусочки кожи инкубировали в 0,5% растворе диспазы в сбалансированном солевом фосфатно-буферном растворе при температуре 37°С в течение часа. Затем кусочки переносили в фосфатный солевой буферный раствор Дульбекко и отделяли эпидермис от дермы. Эпидермис инкубировали в 0,125% растворе трипсина в течение 10-15 минут при перемешивании со скоростью 50 об/мин, после чего действие фермента останавливали добавлением 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Одну треть полученной суспензии клеток использовали в чистом виде для одного из вариантов пересадки на рубцы, вторую треть выращивали на биосовместимых отечественных пленочных покрытиях «Полипор», третью - на чашках Петри без подложки. Операция дермабразии полученных рубцов у крыс с последующей пересадкой на них крысиных эпидермоцитов осуществлялась под эфирным наркозом с помощью термокаутера.

Первой группе крыс после дермабразии на отшлифованную, промытую физиологическим раствором и высушенную поверхность рубца накладывались стерильные кусочки батиста, на которые наносилась взболтанная суспензия аллогенных крысиных эпидермоцитов в концентрации 1,5 миллиона клеток в 1 мл (по данным института Цитологии). Батистовые кусочки укладывались на отшлифованный рубец так, чтобы клетки легли на поверхность рубца. Сверху накладывалась повязка из нескольких слоев марли, которая пришивалась к краям рубца.

Часть полученной взвеси клеток высевали в чашки Петри на стерильные пленки «Полипор», вырезанные по форме чашек, другая часть - на чашки Петри без пленки. Культивирование осуществляли в среде FAD, состоящей из смеси среды DMEM и F12 в соотношении 3:1. с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 5 мкг/мл инсулина (Sigma), 0,5мкг/мл гидрокортизона гемисукцината (Sigma). 10 мкг/мл эпидермального фактора роста ЭФР (Институт Цитологии РАН, СПб). Вторая и третья группы крыс по 7 особей были прооперированы через 6 дней после первой. К этому времени в чашках Петри из суспензии высеянных кератиноцитов образовывались многослойные пласты, которые и пересаживались крысам. Второй группе пересаживались эпидермоциты на пленке, третьей - многослойным пластом без подложки. Через 7 дней, полученные многослойные пласты аллогичных кератиноцитов (МПАлК), высеянные на пленках «Полипор» пересаживались культурой непосредственно на раневую поверхность. Сверху пленка, во избежание ее сдирания фиксировалась многослойной марлевой повязкой и пришивалась к коже крыс.

Перед пересадкой кератиноцитов третьей группе крыс, выращенных без подложки, производилось отделение ПАК от дна чашки Петри обработкой диспазой, обладающей способностью избирательно нарушать дермо-эпидермальные связи. При действии на многослойный пласт диспаза разрушает связь клеток базального слоя с дном чашки Петри и в значительно меньшей степени влияет на межклеточные связи, что дает возможность   «снимать» пласт целиком. Открепления многослойного клеточного пласта диспазой осуществлялось следующим образом. Из чашек Петри сливалась транспортная среда, клеточные пласты трижды промывались питательной средой, содержащей антибиотики, в частности - гентамицин (0,2 мг/мл). Многослойные пласты заливались 0,125% раствора диспазы («Sigma») и помещались в термостат, где их инкубировали при t=37°C в течение 20-30 минут. Появление белого венчика, отслаивающегося по периферии пласта - показатель начала процесса отделения его от краев и дна чашки Петри. Через несколько минут после начала процесса отделения, раствор диспазы сливался, эпителиальные пласты 2-3 раза промывались средой. На поверхность эпидермального пласта накладывали, вырезанный по размеру чашки кусок стерильной раневой повязки "Лита-цвет, к которому прилипал отделенный диспазой пласт, дополнительно отслоенный от дна чашки шпателем. С помощью глазных пинцетов пласт вместе с покрытием из салфетки «Лита-цвет» (Россия) отрывался от дна чашки Петри и осторожно переносился на подготовленную поверхность рубца. Салфетки «Лита-цвет» содержат в своем составе гентамицин и эксолин (экстракт коллагена), который при увлажнении остатками ростковой среды и в дальнейшем физиологическим раствором разбухал и становился современным раневым покрытием, обеспечивающим хорошую защиту от внешней инфекции и быстрое заживление благодаря влагоемкой структуре.

На пленки «Полипор» и салфетки «Лита-цвет» накладывались многослойные марлевые повязки, которые пришивались к коже крыс для более прочной их фиксации. Каждая крыса отсаживалась в отдельную клетку, для создания оптимальных условий ее содержания и приживления пересаженных кератиноцитов. Повязки крыс, которым пересаживалась суспензия и многослойный пласт эпидермоцитов, снятый диспазой, ежедневно по несколько раз в день увлажнялись стерильным физиологическим раствором, для создания клеткам наиболее благоприятных условий для приживления. Учитывая, что пленка «Полипор» была непроницаема для воды, крысам второй группы увлажнение повязок не производилось, что было одним из преимуществ перед пересадками без пленок. Через 10 дней повязки были удалены. Клиническая картина рубцов после трансплантации клеток мало чем отличалась от рубцов без трансплантации, за исключением более розовой их окраски (за счет дермабразии) и большего шелушения. Этот факт говорит о том. что сразу после отпадения раневых покрытий с МПК в рубце не произошло никаких изменений.

Взятие биопсийного материала у крыс.

Через 1, 2, 5 и 9 месяцев после пересадки крысиных аллогичных кератиноцитов на шлифованные рубцы белых крыс, производилось взятие материала для гистологического, цитоморфологического и электронномикроскопического исследования. В качестве контроля были взяты образцы нормальной крысиной кожи и рубца без трансплантации клеток. Анестезия крысам осуществлялась с помощью эфирного наркоза.

После анестезии из отмеченных участков, на которые пересаживались кератиноциты, биопсийным пробойником диаметром 2 мм. брались кусочки рубцовой ткани и помещались в 2,5% раствор глютарового альдегида для подготовки материала к электронномикроскопическому исследованию. Кусочки тканей, взятые для гистологического исследования, помещались в 10% раствор нейтрального формалина с последующей проводкой через спирты и заливкой в парафин, с последующей нарезкой ультратонких срезов и просмотром их в светооптическом микроскопах.

Контроль I. Нормальная кожа крысы.

Для того чтобы увидеть разницу между микроскопической картиной нормальной рубцово-измененной кожи крыс и рубцов через определенные сроки после пересадки МПК, демонстрируются фотографии и описания к ним на всех этапах данного исследования.

Эпидермис нормальной кожи состоит из 7-9 слоев клеток. Роговой слой умеренной толщины. Местами состоит из 6-8 слоев роговых чешуек. Базальный слой представлен клетками циллиндрической формы с крупными светлыми, правильной формы ядрами и несколькими ядрышками. Четко выражены десмосомальные связи между клетками и с базальной мембраной. Под хорошо выраженной базальной мембраной, которая имеет мелкие выросты в субэпидермальный слой, параллельно ей лежат нежные пучки коллагеновых и эластиновых волокон, среди которых удлиненной формы фибробласты, мелкие сосуды. В более глубоких слоях пучки коллагеновых и эластиновых волокон лежат в разных направлениях. Среди них много сосудов с тонкими стенками одинакового калибра, клеточных элементов (фибробласты. тучные клетки, лейкоциты). В большом количестве волосяные фолликулы, сальные железы.

Контроль 2. Рубец крысы 2-х месячной давности.

Клиническая картина. Рубцы бледно-розовые, с шелушением, местами сохраняются корочки. Их площадь уменьшилась за счет контракции коллагеновых волокон и стала приблизительно 3,0-3,5 см^:. Придатки кожи отсутствуют.

Микроскопическая картина. Эпидермис состоит из 3-5 слоев клеток, складчатый, представлен базальными клетками округлой формы, одним рядом шиловидных, 1-2 рядами зернистых с зернами кератогиалина в верхнем слое, имеются участки внутриклеточного отека. Роговой слой неоднородно изменен от очень тонкого до утолщенного. Отмечается складчатость рубца за счет (контракции) рубцовой ткани. Складки проникают до сосочкового слоя и создают впечатление сосочков. Граница между эпидермисом и дермой представляет собой прямую линию. Базальная мембрана не везде прослеживается. В нижней части субэпидермального и более глубоких слоев - сосуды с толстой, разрыхленной стенкой, много запустевших, с явлениями стаза. Вокруг сосудов - скопление макрофагов, фибробластов. Макрофаги обступают вышедшие из капилляров эритроциты и фагоцитируют их. В более поверхностных слоях - мелкие капилляры. Под эпидермисом коллагеновые волокна рыхло расположены. В более глубоком слое рубца - грубые пучки коллагеновых волокон среди которых много фибробластов.

Рубец крысы через месяц после пересадки МПАл крысиных кератиноцитов.

Клиническая картина. Рубцы розовые, их площадь уменьшилась, особенно в поперечнике и составляет в среднем 2,5-3 см². Волосы и сальные железы отсутствуют.

Данные микроскопического исследования материала, полученного от крыс с пересадкой МПАлК на пленке и МПАлК без подложки, практически одинаковы. Однако чисто технически работа с МПАлК без подложки на много сложнее и кропотливее, чем при выращивании МПАлК на подложке, поэтому при дальнейшем изучении вопроса пересадки кертаиноцитов на рубцы мы использовали в качестве основы для выращивания («подложек») многослойный батист.

Микроскопическая картина. Отмечается утолщение эпидермиса до 15-20 слоев, практически до середины которого кератиноциты имеют узкую, удлиненную, вертикальную форму и компактное расположение. Базальные клетки располагаются неровной линией. Их ядра светлые, крупные, округлой формы с одним или двумя ядрышками, что говорит о их высокой синтетической и пролиферативной активности. Граница между эпидермисом и дермой представляет собой прямую линию. Шиповатый слой хорошо развит, состоит из 3-5 слоев клеток округлой формы, имеются 2-х ядрышковые клетки.

Сразу под базальной мембраной - плотнорасположенные тонкие пучки коллагеновых волокон, параллельно им большое количество запустевших сосудов, глубже коллагеновые волокна более грубые, собранные в плотные пучки. Много крупных фибробластов, тучных клеток (2-3 в поле зрения), макрофагов, лейкоцитов и запустевших сосудов, стенки которых разрыхлены, вокруг них - рыхло расположенные коллагеновые волокна. В некоторых сосудах - стаз, диапедез форменных элементов. Вокруг сосудов - фибробласты, единичные лимфоциты. Придатки кожи отсутствуют.

При пересадке на шлифованный рубец суспензии кератиноцитов микроскопическая картина отличается от предыдущей. У большинства животных - эпидермис тонкий, состоит из 5-6 слоев клеток. Нижний слой состоит из клеток неправильной, полигональной формы с ядрами округло-неправильной формы. Состояние субэпидермального слоя аналогично его состоянию в группе животных без пересадки МПАлК.

В данном случае можно говорить либо о запаздывании процессов, сопутствующих трансплантации клеток, либо о большой потере клеток, пересаженных в виде суспензии. Отсюда был сделан вывод о нецелесообразности коррекции рубцов пересадкой кератиноцитов в виде суспензии.

Рубец крысы через 2 месяца после пересадки МПАл крысиных кератиноцитов.

Клиническая картина. Рубец выглядит тонким, нежным. Местами отмечается шелушение, чешуйки.

Микроскопическая картинa. Роговой слой утолщен, местами - гиперкератоз. Эпидермис утолщен, состоит из 12-20 рядов клеток. Граница между эпидермисом и дермой представляет собой прямую линию. Нежные коллагеновые волокна под эпидермисом лежат достаточно плотно. В более глубоких слоях рубца они собраны в грубые большие пучки. В субэпидермальном слое появляется новообразование сосудов. В более нижних слоях рубцовой ткани - много запустевших сосудов, располагающихся параллельно поверхности эпидермиса. Крупные фибробласты равномерно распределены в толще рубца, имеются гигантские, многоотростчатые, много макрофагов.

Рубец крысы через 5 месяцев после пересадки МП крысиных зпидермоцитов.

Клиническая картина. Рубец выглядит ровным, гладким без шелушения, имеются единичные волосы, их густота больше на периферии рубцов, что говорит о краевом врастании волосяных фолликулов в рубец и новообразование волосяных фолликулов. Площадь рубцов продолжает уменьшаться.

Микроскопическая картина. Эпидермис по-прежнему толстый (15-20 слоев, местами до 30) в верхних слоях заполнен зернами кератогиалина. Четко видна базальная мембрана. Под ней коллагеновые волокна лежат рыхло. В нижних слоях - коллаген более мощный и плотно упакован. Среди пучков коллагена много капилляров.. В верхних слоях уменьшилось количество запустевших сосудов. Соединение эпидермиса и дермы слегка волнообразное. Местами имеются глубокие эпидермальные выросты в рубцовую ткань. Среди коллагеновых волокон видны новообразованные сосуды. Появляются единичные волосяные фолликулы и сальные железы.

Рубец крысы через 9 месяцев после пересадки МПАл крысиных эпидермоцитов.

Клиническая картина. Рубцы стали значительно меньших размеров по сравнению с более ранними сроками, их площадь в среднем составляет около 1,5-2,0 см². Рубцы неравномерно покрыты тонкими волосами, особенно по периферии. Сохраняется незначительное мелкопластинчатое шелушение.

Микроскопическая картина.

Эпидермис стал тоньше, представлен из 6-8 рядов клеток, напоминает по строению эпидермис нормальной кожи крыс, только плотность клеток на 1 мм. выше и они мельче. Базальный слой состоит из мелких клеток округло-цилиндрической формы. Базальная мембрана хорошо выражена, четко видны полудесмосомы. Отмечается наличие эпидермальных выростов в субэпидермальный слой. Сосочковый слой выражен по всей длине рубца. Данные факты говорят о том, что этому периоду времени сцепление пересаженных кератиноцитов стало значительно более прочным с нижележащими тканями рубца. Следовательно, уход за рубцами людей с пересадкой МПАлК через 9 месяцев после пересадки МПК может быть традиционным. Под эпидермисом более нежные коллагеновые волокна, чем в глубоких слоях. Появилось много сосудов, особенно поверхностно расположенных. В более крупных сосудах стенки утолщены. Волосяные фолликулы и сальные железы в большом количестве. Микроскопическая картина напоминает дермоподобную ткань.

Результаты экспериментальной работы и их обсуждение.

В процессе данной работы на искусственно созданные рубцы кожи крыс, после операции дермабразии, пересаживались кератиноциты в разных формах- на раневых покрытиях, в виде суспензии на батисте и многослойным пластом без подложки. Работа производилась с целью получения морфологических данных о влиянии пересаженных аллогенных кератиноцитов на рубцы, а также определения оптимальных вариантов пересадки.

Было обнаружено, что все три способа пересадки реальны, однако пересадка МПАК без подложки - очень трудоемкая процедура, в процессе которой МПАК может быть травмирован, что отражается на результатах пересадки. Более того, данный способ пересадки исключает работу на больших поверхностях.

Пересадка суспензии кератиноцитов - способ значительно более экономичный, не требует длительного культивирования клеток и прост в предлагаемом нами варианте с использованием стерильных батистовых заготовок, размеры которых соответствуют величине рубцов. Отставание лечебного эффекта при пересадке суспензии клеток приблизительно на месяц по сравнению с МПК на раневом покрытии - не существенный момент при длительности лечения, исчисляемой многими месяцами. Известно, что при пересадке МПК ожоговым пациентам, трансформация состояния структуры кожи происходила постепенно и в течение нескольких лет. Пересадка культуры кератиноцитов на раневых покрытиях - самый удобный и перспективный метод, однако и значительно более дорогостоящий. К тому же, требующий на сегодняшний день поиска более совершенных вариантов покрытий, которые должны быть пластичными, гигроскопичными, обладать бактериостатическими или бактерицидными свойствами и быть биологически нейтральны для клеток. Пленка «Полипор» - промежуточный вариант отечественного пленочного раневого покрытия, несмотря на некоторое несовершенство, позволила нам изучить в эксперименте пересадку кератиноцитов крыс на рубцы и сделать выводы об эффективности данного направления влечении рубцов.

Авторы, производившие пересадку МПК на раны обожженных, отмечали, что в течение первой недели после трансплантации многослойного пласта кератиноцитов на санированные раны, эпидермис утолщался и стратифицировался. Все слои эпидермиса были хорошо выражены. Интересно, что количество клеточных слоев в трансплантантах на 10-30% больше, чем в биоптатах кожи. Авторы отмечали появление гранул кератогиалина на 5-е сутки после пересадки MПК, базальной мембраны и полудесмосом - уже на 3-й сутки.

J.Rives et al..(l994), Парамонов Б.А.(1996); Кузнецов Н.М и др. (1998), установили, что в ранние сроки после трансплантации МПК пациентам с полнослойными дефектами кожи после ожогов, связь между дермой и эпидермисом очень слабая и представляет собой прямую линию, сосочковый слой отсутствует. К исходу 2-го месяца начинается формирование неглубоких сосочков и придатков кожи, связь дермы и эпидермиса становится более прочной. Данные литературы говорято пересадке аллогенных кератиноцитов на раны обожженным пациентам, как о перспективном методе. Несмотря на то, что отторжение аллогенных кератиноцитов происходит поданным разных авторов в сроки от 10 дней до 3-х месяцев, тем не менее они выполняют свою роль в заживлении раневой поверхности, выделяя факторы роста и механически закрывая дефект. Считают, что МПАлК обладают сниженной антигенной активностью, так как при культивировании in vitro теряют клетки Лангерганса, что позволяет им длительное время существовать в организме реципиента. Кроме того, аллогенная культура, полученная из кожи молодых здоровых людей обладает несравненно большим биологическим потенциалом, чем аутологичная культура пациентов после травмы.

Основной целью нашего исследования было выяснить будут ли приживаться аллогенные кератиноциты на рубцы и каковы будут изменения в рубцовой ткани под влиянием такого биологически активного «раневого покрытия». В случае положительного результата, отработать максимально эффективную и наименее трудоемкую технологию данного направления реабилитационной медицины.

Полученные нами данные во многом оказались сходными с данными литературы о морфологических изменениях, происходящих в эпидермисе человека после пересадки аллогенных кератиноцитов на ожоговые раны. Но есть и существенные отличия, как в плане морфологического субстрата, на который происходит трансплантация, так и в плане технологии. Так. процесс образования базальной мембраны и дермо-эпидермальных связей (полудесмосом, сосочков) происходит в более поздние сроки по сравнению с пересадкой кератиноцитов на раневые поверхности без рубцовых изменений. По видимому, это происходит за счет более плохого питания тканей рубца по сравнению с дермой или фасциями мышц. Рубец, особенно старый - это плотная соединительная ткань с очень незначительным количеством сосудов, дно ожоговой раны представляет собой грануляционную ткань, богатую сосудами. Таким образом, очевидно, что условия, в которых происходит трансплантация и приживление кератиноцитов абсолютно различные. Чем более васкуляризирована область пересадки клеток, тем легче идет процесс их приживления. Из этого постулата вытекает вывод о предпочтительности работы с молодыми рубцами, в которых соединительная ткань еще достаточно рыхлая и богата сосудами.

В результате этой экспериментальной работы доказано, что:

1. Пересадка МПАлК на рубцы возможна. 
2. Оптимальным способом пересадки является пересадка кератиноцитов на раневом покрытии.
3. Поверхность рубца должна быть отшлифована с помощью оперативной дермабразии лазером или фрезой Шумана.
4. Под влиянием МПАлК происходит быстрая эпителизация отшлифованной поверхности рубца.
5. Чем лучше васкуляризирована ткань рубца, то есть чем моложе рубец, тем лучше результаты трансплантации кератиноцитов.
6. Ткань рубца под влиянием пересаженных кератиноцитов постепенно трансформируется и превращается в дермоподобную (более рыхлую рубцовую ткань с придатками кожи).
7. Постепенное разрыхление рубцовой ткани, начинается с субэпидермального слоя. Улучшается ее васкуляризация, пучки коллагеновых волокон в верхней и нижней частях рубца принимают более рыхлое расположение, чем в рубцовой ткани без трансплантации клеток. Появляются волосяные фолликулы и сальные железы. Эпидермис по своему строению, пройдя фазу гипертрофии, приближается к эпидермису нормальной кожи.
8. Наблюдаемые изменения связаны с выделяемыми кератиноцитами факторами роста, цитокинами, которые улучшая трофику рубцовой ткани способствуют ее трансформации из грубой фиброзной ткани в более рыхлую, что и приводит к улучшению вида рубца.

Таким образом, на основании данного исследования можно сделать вывод о благоприятном влиянии трансплантированных кератиноцитов на рубцовую ткань, что может иметь практическое значение для реабилитации пациентов с различного вида рубцами.

Данная работа на крысах позволила также сформулировать требования. предъявляемые к раневым покрытиям, на которых выращиваются кератиноциты.

Раневые покрытия должны быть:

• биосовместимыми с клетками,
• воздухопроницаемыми,
• иметь эластичную, формообразующую основу,
• быть гидрофильными,
• в качестве лекарственных добавок содержать антибактериальные препараты и антиоксиданты не токсичные для культивированных клеток.

Клинические результаты биотехнологического лечения рубцов.

Ранее работами N.Carver et al. (1993) было установлено, что окклюзионные повязки лучше всего способствует прикреплению к ране и выживанию кератиноцитов, но не позволяют формироваться стратифицированному (зрелому) эпидермису. Для образования стратифицированного эпидермиса необходимо воздушное окружение. Поэтому после прикрепления многослойного пласта окклюзионное раневое покрытие предлагалось через 7-10 удалять и вести раны под сухими повязками или водорастворимыми мазями. Можно сказать, что качество и свойства «подложки», на которой выращиваются клетки являются очень важным моментом для эффективности трансплантации клеточного материала, а следовательно для результатов работы врачей. Но идеального раневого покрытия на сегодняшний день нет, несмотря на обилие предлагаемых вариантов (искусственная кожа, нетканное полотно из карбоксиметилцеллюлозы, фибринные покрытия, полупроницаемые полиуретановые пленки). Не маловажным моментом в этом вопросе является стоимость «подложек» (специальных раневых покрытий), так как их дороговизна увеличивает общую стоимость биотехнологического лечения.

Эффективность клеточных технологий на сегодняшний день доказана, но, к сожалению, эти технологии очень дороги, особенно в странах, где не налажено промышленное производство клеточных композиций. Тем не менее, такие страны, как США уже давно наладили индустрию по производству клеточного материала для трансплантации обожженным. В частности, компания BioSurface Technology Inc, начиная с 1989 года, вырастила 37 000 многослойных пластов кератиноцитов, которые были использованы для лечения 240 больных в 79 странах мира (R.Odessey, 1992) при этом 1 см² клеточной культуры стоит около 7-8 $ США.

Технология лечения различных заболеваний и проблем кожи имеет целый ряд отличий, но в основе любого лечения клетками лежит получение качественного клеточного материала и его трансплантация.

Этот процесс состоит из следующих этапов:

• отбор кожи у пострадавших (или у доноров),
• транспортировка лоскутов кожи в биотехнологический центр,
• выделение клеток базального слоя и их размножение,
• наращивание многослойных пластов кератиноцитов (МПК).
• трансплантация клеточных культур.

Основной проблемой при проведении лечения с помощью пересадки многослойных пластов кератиноцитов является необходимость наличия жизнеспособных клеток на всех этапах клеточной трансплантации. Кусочки кожи для выделения аутологичных или аллогенных клеток должны быть максимально тонкими, так как в этом случае их легче разделить, используя механические и ферментативные методы и получить суспензию живых клеток для выращивания. Их можно получать, срезая дерматомом или используя кожу век, крайней плоти, внутренней поверхности плеча. Учитывая, что клетки чувствительны к галогенам (хлор, йод), перекиси водорода, их нельзя использовать при обработке кожи во время взятии материала.

Количественный и качественный выход клеток из кожных лоскутов и эффективность их культивирования зависят также от состояния здоровья и возраста донора. Кроме того, кожные биоптаты должны быть максимально быстро и в соответствующих условиях (среда, температура) доставлены в сертифицированнную и акредитованную для этих целей лабораторию.

Для хранения и транспортировки лоскутов кожи могут быть использованы среда Игла или среда 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, среда DMEM с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки и антибиотиков.

В цитологической лаборатории кожный биоптат сначала механически разделяют на мелкие кусочки, затем идет обработка кожных кусочков с помощью ферментов: трипсина, коллагеназы, диспазы и др.

Под действием ферментов происходит разрушение десмосом и кератиноциты высвобождаются в среду в виде отдельных клеток или агрегатов, состоящих из разного количества клеток. Для культивирования используют только базальные кератиноциты, которые выращивают на специальных средах в термостатах, содержащих 5 % CO., в чашках Петри или во флаконах при t=37°C. Уже через 48 часов наблюдается образование колоний кератиноцитов, которые постепенно сливаясь превращаются в монослой. После получения достаточного количества клеток, полученную суспензию рассевают на раневые покрытия, подготовленные для этой цели и помещенные в чашки Петри. Из суспензии формируется сначала монослой а затем и многослойный пласт кератиноцитов. Схематично этапы процесса культивирования кератиноцитов представлены на рис. 12 (33,43,54,65).

Формирование многослойного пласта кератиноцитов, пригодного для пересадки занимает обычно 7-10 дней. Иногда этот срок оказывается больше, что зависит от качества исходного материала (возраста, состояния здоровья донора, правильности взятия материала, качества используемых сред и др.). Если многослойный пласт переростает, то на его поверхности могут оказаться клетки с явлениями апоптоза, непригодные для трансплантации. Чашки Петри, с выращенным в них на раневых покрытиях многослойными пластами кератиноцитов (МПК), доставляются в клинику в специальных контейнерах при  температуре не ниже +15° С.

Модифицированная методика Грина по выращиванию МПК

В своей работе в качестве раневого покрытия мы использовали многослойный батист, отказавшись от пленок «Полипор», с которыми мы начинали работать в эксперименте с крысами. Таким образом, многослойные пласты кератиноцитов выращивались нами на предварительно обезжиренном и стерильном батисте, хотя он также не является оптимальным раневым покрытием.

Клинические исследования проводились на волонтерах с соблюдением необходимых этических норм: подписания договора и информированного согласия.

1. Применялась культура собственных (аутологичных) и взятых из банка клеток (аллогенных) кератиноцитов.
2. Собственные кератиноциты получали из кусочка кожи, вырезанной с внутренней стороны плеча пациентов.
3. Операция дермабразии рубцов проводилась с помощью термокаустики, ротационных дисков и эрбиевого лазера.
4. Были взяты группы пациентов с нормотрофическими, гипотрофическими и гипертрофическими рубцами.

Технологический процесс по применению клеточных технологии для улучшения вида рубцов кожи состоял из следующих этапов:

1. Отбор пациентов.
2. Разъяснения сути лечения, сроков получения ожидаемых результатов, подписание договора и информированного согласия.
3. Назначение пациентам за 2-3 недели до операции селмевит по 1т. 3 раза в день, цинктерал по 1т. 3 раза в день.
4. Взятия кусочка кожи длиной 2,0 см и шириной 0,7-1,0 см с внутренней поверхности плеча, высоко, практически в нижней части аксиллярной области для получения аутологичных кератиноцитов.
5. В случае отказа пациентов на выделение собственных кератиноцитов из-за возможности получения линейного рубца на внутренней поверхности плеча, клеточный материал брался из банка клеток (аллогенные кератиноциты).
6. Кератиноциты выделялись и выращивались в условиях сертифицированной для этого рода работ лаборатории.
7. После получения МПК достаточного для трансплантации на рубцы назначался день операции в клинике, куда привозился в специальных контейнерах материал в чашках Петри.
8. Производилась операция дермабразии рубца, гемостаз, отшлифованная поверхность промывалась стерильным физиологическим раствором, высушивалась, после чего на нее пересаживались МПК на стерильном батисте «клетками вниз». То есть клетки, которые были верхними в МПК оказывались нижними, прилегающими к отшлифованной поверхности.
9. Сверху накладывалась стерильная пленка, которая фиксировалась к коже эластичным бинтом или эластичным пластырем Omnifix. Вместо пленки можно использовать и индифферентные раневые покрытия, содержащие силикон, например Mepitel, Mepiform, пластины силиконового геля.

Через 5-7 дней пленка или силиконовое покрытие удаляется. К этому времени все кератиноциты должны переползти на отшлифованный рубец и прикрепиться к его поверхности.

10. Влажная среда, созданная под пленкой и силиконовым покрытием этому активно способствует. Батист, остающийся на рубце с этого момента можно пропитывать куриозином или хитозановым гелем. В результате на 2-ой день создается плотная корка, которую, для удобства пациента лучше фиксировать эластичным, воздухопроницаемым пластырем, например Omnifix. Воздухопроницаемая корка позволяет образовавшемуся эпидермису дифференцироваться и превращаться в зрелый.

В зависимости от вида рубца и глубины шлифовки, повязка отторгается через 8-10 дней. Эпидермис в это время имеет на 30-40% больше клеточных слоев, чем в нормальной коже. Базальная мембрана не сформирована. Кератиноциты утолщенного эпидермиса выделяют в рубцовую ткань массу биологически активных молекул.

Успех биотехнологического лечения рубцов во многом зависит от способа ухода за ними в послеоперационном периоде. Клеточные культуры являются «нежным» видом раневого покрытия и в ранние сроки после пересадки МПК могут   быть   легко отслоены от подлежащих тканей. Поэтому пациентам рекомендуется бережно обращаться с рубцом после операции. В течение 8-9 месяцев не тереть и легко обрабатывать холодной кипяченой водой во избежание сдирания тонкого, вновь созданного эпидермиса, который не имеет плотного сцепления с нижележащими тканями.

Примечание.

Перед операцией и в процессе дермабразии применение галогенсодержащих антисептиков и окислителей (йодопирон, сульйодопирон, иодинол, йодинат, хлоргексидин, перекись водорода) допустимо, перед пересадкой клеток- категорически противопоказано из-за их цитотоксического действия. Токсичными для клеток также являются также метиленовый синий. бриллиантовый зеленый.

Во избежание присоединения инфекции, особенно при работе с гипертрофическими рубцами, возможна обработка операционного поля неомицином сульфатом, полимиксином или гентамицином. Они не оказывают цитотоксического эффекта на кератиноциты.

В результате такого лечения достигается тройной эффект.

1. Выравнивание поверхности рубца.
2. Создание над ним слоя нового эпидермиса, нормальной толщины.
3. Превращение рубцовой ткани в дермоподобную за счет действия, цитокинов, факторов роста и других биологически активных молекул, выделяемыми пересаженными клетками и стимулированными ими кератиноцитами, фибробластами и макрофагами.

Рубец становится менее заметным, более эластичным, в нем появляются поры, пушковые волосы, может восстановиться пигментация за счет наличия в МПК меланоцитов.

Однако все эти положительные моменты в рубце наступают не сразу. В связи с этим необходимо предупреждать пациентов. о том, что процесс трансформации рубцовой ткани в дермоподобную происходит медленно и оптимальный результат такого лечения можно ожидать не ранее чем через 10-14 месяцев. Сразу после отторжения повязок, шлифованные поверхности имеют выраженную полихромность, тем ярче, чем глубже производилась шлифовка. Наименьшие повреждения кожи отмечаются при шлифовке нормотрофических рубцов эрбиевым лазером. Цвет рубцов и окружающей кожи восстанавливался в сроки от 3 до 8 недель. Несмотря на такие меры предосторожности, иногда возникает послеоперационная гиперпигментация, которая может самостоятельно пройти в течение нескольких месяцев.

[3], [4], [6], [7], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]