Гемопоэтические стволовые клетки желточного мешка

Вопросы происхождения гемопоэтических стволовых клеток

Тот факт, что эмбриональное образование эритроцитов берет свое начало в кровяных островках желточного мешка, не вызывает сомнений. Однако дифференцировочный потенциал in vitro гемопоэтически х клеток желточного мешка весьма ограничен (они дифференцируются преимущественно в эритроциты). Следует отметить, что трансплантация гемопоэтических стволовых клеток желточного мешка не способна восстановить гемопоэз на длительное время. Оказалось, что не эти клетки являются предшественниками ГСК взрослого организма. Истинные ГСК появляются раньше, на 3-5-й неделе внутриутробного развития, в зоне формирования тканей желудка и эндотелия кровеносных сосудов (paraaortic splanchnopleura, P-SP), а также в месте закладки аорты, гонад и первичных почек - в области мезонефроса или так называемого AGM-района. Показано, что клетки AGM-района являются источником не только ГСК, но и эндотелиальных клеток кровеносных сосудов, а также остеокластов, вовлекаемых в процессы формирования костной ткани. На 6-й неделе гестации ранние гемопоэтические клетки-предшественники из AGM-района перемещаются в печень, которая остается основным кроветворным органом плода до самого рождения.

Поскольку этот момент крайне важен с точки зрения клеточной трансплантации, проблема происхождения ГСК в процессе эмбриогенеза человека заслуживает более подробного изложения. Классические представления о том, что гемопоэтические стволовые клетки млекопитающих и птиц происходят из экстраэмбрионального источника, основаны на исследованиях Меткалфа и Мура, которые впервые использовали методы клонирования ГСК и их потомков, выделенных из желточного мешка. Результаты их работ послужили основой для миграционной теории, согласно которой ГСК, впервые возникнув в желточном мешке, последовательно заселяют транзиторные и дефинитивные кроветворные органы по мере формирования в них соответствующего микроокружения. Вот так и утвердилась точка зрения, что генерация ГСК, первоначально локализованная в желточном мешке, служит клеточной основой дефинитивного гемопоэза.

Кроветворные родоначальные клетки желточного мешка относятся к категории наиболее ранних клеток-предшественников гемопоэза. Их фенотип описывается формулой AA4.1+CD34+c-kit+. В отличие от ГСК зрелого костного мозга, они не экспрессируют антигены Sca-1 и молекулы МНС. Казалось бы, что появление маркерных антигенов на поверхностных мембранах ГСК желточного мешка при культивировании соответствует их дифференцировке в процессе эмбрионального развития с формированием коммитированных линий гемопоэза: снижается уровень экспрессии антигена CD34 и Thy-1, повышается экспрессия CD38 и CD45RA, появляются молекулы HLA-DR. При последующей, индуцированной цитокинами и факторами роста, специализации in vitro начинается экспрессия антигенов, специфичных для гемопоэтических клеток-предшественников определенной клеточной линии. Однако результаты изучения эмбрионального кроветворения у представителей трех классов позвоночных животных (амфибий, птиц и млекопитающих) и, в особенности, анализ происхождения ГСК, ответственных за дефинитивный гемопоэз в постнатальном онтогенезе, противоречат классическим представлениям. Установлено, что у представителей всех рассмотренных классов в эмбриогенезе формируются две независимые области, в которых возникают ГСК. Экстраэмбриональная “классическая” область представлена желточным мешком или его аналогами, тогда как недавно выявленная интраэмбриональная зона локализации ГСК включает парааортальную мезенхиму и AGM-район. Сегодня можно утверждать, что у амфибий и птиц дефинитивные ГСК происходят из интраэмбриональных источников, тогда как у млекопитающих и человека участие ГСК желточного мешка в дефинитивном гемопоэзе полностью исключить еще нельзя.

Эмбриональное кроветворение в желточном мешке является, по сути, первичным эритропоэзом, для которого характерно сохранение ядра на всех стадиях созревания эритроцитов и синтез гемоглобина фетального типа. Согласно последним данным, волна первичного эритропоэза завершается в желточном мешке на 8-е сутки эмбрионального развития. За ней следует период накопления дефинитивных эритроидных клеток-предшественников - BFU-E, которые образуются исключительно в желточном мешке и впервые появляются на 9-е сутки гестации. На следующей стадии эмбриогенеза уже формируются дефинитивные эритроидные клетки-предшественники - CFU-E, а также (!) тучные клетки и CFU-GM. Именно на этом основано существование точки зрения, согласно которой дефинитивные клетки-предшественники возникают в желточном мешке, мигрируют с кровотоком, оседают в печени и быстро инициируют первую фазу интраэмбрионального кроветворения. По таким представлениям, желточный мешок можно рассматривать, с одной стороны, как место первичного эритропоэза, а с другой - как первый источник дефинитивных клеток-предшественников гемопоэза в эмбриональном развитии.

Показано, что колониеобразующие клетки с высоким пролиферативным потенциалом можно выделить из желточного мешка уже на 8-е сутки гестации, то есть, задолго до замыкания сосудистой системы зародыша и желточного мешка. Причем полученные из желточного мешка клетки с высоким пролиферативным потенциалом in vitro образуют колонии, размер и клеточный состав которых не отличаются от соответствующих параметров культурального роста стволовых клеток костного мозга. В то же время при ретрансплантации колониеобразующих клеток желточного мешка с высоким пролиферативным потенциалом формируется значительно больше дочерних колониеобразующих клеток и мультипотентных клеток-предшественников, чем при использовании костномозговых клеток-предшественников гемопоэза.

Окончательное заключение о роли гемопоэтических стволовых клеток желточного мешка в дефинитивном кроветворении могли бы дать результаты работы, в которой авторы получили линию эндотелиальных клеток желточного мешка (G166), которая эффективно поддерживала пролиферацию его клеток с фенотипическими и функциональными характеристиками ГСК (AA4.1+WGA+, низкая плотность и слабые адгезивные свойства). Содержание последних при культивировании на фидерном слое клеток С166 в течение 8 суток увеличивалось более чем в 100 раз. В смешанных колониях, выросших на подслое из клеток линии С166, были идентифицированы макрофаги, гранулоциты, мегакариоциты, бластные клетки и моноциты, а также клетки-предшественники В- и Т-лимфоцитов. Клетки желточного мешка, растущие на подслое из эндотелиальных клеток, обладали способностью к самовоспроизводству и выдерживали в экспериментах авторов до трех пассажей. Восстановление с их помощью гемопоэза у половозрелых мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) сопровождалось образованием всех типов лейкоцитов, а также Т- и В-лимфоцитов. Однако авторы в своих исследованиях использовали клетки желточного мешка 10-суточного зародыша, у которого экстра- и интраэмбриональные сосудистые системы уже замкнуты, что не позволяет исключить присутствия среди клеток желточного мешка ГСК интраэмбрионального происхождения.

В то же время анализ дифференцировочного потенциала кроветворных клеток ранних стадий развития, выделенных до объединения сосудистых систем желточного мешка и зародыша (8-8,5 суток гестации), выявил наличие предшественников Т- и В-клеток в желточном мешке, но не в теле зародыша. В системе in vitro методом двухступенчатого культивирования на монослое из эпителиальных и субэпителиальных клеток тимуса мононуклеарные клетки желточного мешка дифференцировались в пре-Т- и зрелые Т-лимфоциты. В тех же условиях культивирования, но на монослое из стромальных клеток печени и костного мозга мононуклеары желточного мешка дифференцировались в пре-В-клетки и зрелые IglVT-B-лимфоциты.

Результаты этих исследований свидетельствуют о возможности развития клеток иммунной системы из экстраэмбриональной ткани желточного мешка, причем формирование первичных Т- и В-клеточных линий зависит от факторов стромального микроокружения эмбриональных гемопоэтических органов.

В работах других авторов также показано, что желточный мешок содержит клетки с потенциями к лимфоидной дифференцировке, причем образующиеся лимфоциты не отличаются по антигенным характеристикам от таковых у половозрелых животных. Установлено, что клетки желточного мешка 8-9-суточного эмбриона способны восстанавливать лимфопоэз в атимоцитарном тимусе с возникновением зрелых CD3+CD4+- и СDЗ+СD8+-лимфоцитов, обладающих оформленным репертуаром Т-клеточных рецепторов. Таким образом, тимус может заселяться клетками экстраэмбрионального происхождения, однако при этом нельзя исключить вероятной миграции в тимус ранних клеток-предшественников Т-лимфоцитов из интраэмбриональных источников лимфопоэза.

Вместе с тем, трансплантация кроветворных клеток желточного мешка взрослым облученным реципиентам далеко не всегда завершается длительной репопуляцией опустошенных зон локализации кроветворной ткани, a in vitro клетки желточного мешка образуют значительно меньше селезеночных колоний, чем клетки AGM-района. В некоторых случаях с помощью клеток желточного мешка 9-суточного зародыша все же удается добиться длительной (до 6 месяцев) репопуляции кроветворной ткани облученных реципиентов. Авторы считают, что клетки желточного мешка с фенотипом CD34+c-kit+ по способности к репопуляции опустошенных кроветворных органов не только не отличаются от таковых из AGM-района, но и более эффективно восстанавливают гемопоэз, поскольку в желточном мешке их содержится почти в 37 раз больше.

Надо заметить, что в экспериментах использовались кроветворные клетки желточного мешка с маркерными антигенами ГСК (c-kit+ и/или CD34+ и CD38+), которые вводились непосредственно в печень или в брюшную вену потомства самок мышей, получавших инъекцию бусульфана на 18-е сутки беременности. У таких новорожденных животных собственный миелопоэз был резко угнетен по причине элиминации стволовых кроветворных клеток, вызванной бусульфаном. После трансплантации ГСК желточного мешка на протяжении И месяцев в периферической крови реципиентов выявлялись форменные элементы, содержащие донорский маркер - глицерофасфатдегидрогеназу. Установлено, что ГСК из желточного мешка восстанавливают содержание клеток лимфоидной, миелоидной и эритроидной линий дифференцировки в крови, тимусе, селезенке и костном мозге, причем уровень химеризма был выше в случае внутрипеченочного, а не внутривенного введения клеток желточного мешка. Авторы полагают, что ГСК желточного мешка зародышей ранних стадий развития (до 10 суток) для успешного заселения кроветворных органов взрослых реципиентов нуждаются в предварительном взаимодействии с кроветворным микроокружением печени. Не исключено, что в эмбриогенезе существует уникальная стадия развития, когда клетки желточного мешка, мигрируя первоначально в печень, приобретают затем способность заселять строму кроветворных органов половозрелых реципиентов.

В связи с этим надо заметить, что химеризм клеток иммунной системы довольно часто наблюдается после трансплантации клеток костного мозга облученным половозрелым реципиентам - в крови последних клетки донорского фенотипа в достаточно большом количестве встречаются среди В-, Т-лимфоцитов и гранулоцитов реципиента, что продолжается не менее 6 месяцев.

Морфологическими методами кроветворные клетки у млекопитающих впервые выявляются на 7-е сутки развития зародыша и представлены кроветворными островками внутри сосудов желточного мешка. Однако естественная кроветворная дифференцировка в желточном мешке ограничена первичными эритроцитами, сохраняющими ядра и синтезирующими фетальный гемоглобин. Тем не менее, традиционно считалось, что желточный мешок служит единственным источником ГСК, мигрирующих в кроветворные органы развивающегося зародыша и обеспечивающих дефинитивный гемопоэз у взрослых животных, поскольку появление ГСК в теле эмбриона совпадает с замыканием сосудистых систем желточного мешка и зародыша. В пользу этой точки зрения свидетельствуют данные о том, что клетки желточного мешка при клонировании in vitro дают начало гранулоцитам и макрофагам, a in vivo - селезеночным колониям. Затем в ходе трансплантационных экспериментов было установлено, что кроветворные клетки желточного мешка, которые в самом желточном мешке способны дифференцироваться только в первичные эритроциты, в микроокружении печени новорожденных и взрослых SCID-мышей, опустошенного тимуса или стромального фидера приобретают способность к репопуляции кроветворных органов с восстановлением всех линий гемопоэза даже у взрослых животных-реципиентов. В принципе, это позволяет отнести их к категории истинных ГСК - как клеток, функционирующих и в постнатальном периоде. Допускается, что желточный мешок, наряду с областью AGM, служит источником ГСК для дефинитивного кроветворения у млекопитающих, однако до сих пор неясен их вклад в развитие кроветворной системы. Не понятен и биологический смысл существования в раннем эмбриогенезе млекопитающих двух кроветворных органов со сходными функциями.

Поиск ответов на эти вопросы продолжается. In vivo удалось доказать присутствие в желточном мешке 8-8,5-суточных зародышей клеток, восстанавливающих лимфопоэз у сублетально облученных SCID-мышей с выраженным дефицитом Т- и В-лимфоцитов. Кроветворные клетки желточного мешка вводились как внутрибрюшинно, так и непосредственно в ткань селезенки и печени. Через 16 недель у реципиентов выявлялись TCR/CD34\ CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты и B-220+IgM+ В-лимфоциты, маркированные донорскими антрхгенами МНС. При этом в теле 8-8,5-суточных зародышей стволовых клеток, способных к такому восстановлению иммунной системы, авторы не обнаружили.

Кроветворные клетки желточного мешка обладают высоким пролиферативным потенциалом и способны к длительному само- воспроизводству in vitro. Некоторые авторы идентифицируют эти клетки как ГСК на основании длительной (почти 7 месяцев) генерации эритроидных клеток-предшественников, отличающихся от костномозговых родоначальников эритроидной линии большей продолжительностью пассирования, большими размерами колоний, повышенной чувствительностью к ростовым факторам и более длительной пролиферацией. Кроме того, при соответствующих условиях культивирования клеток желточного мешка in vitro образуются и клетки-предшественники лимфоидного ряда.

Приведенные данные в общем позволяют считать желточный мешок источником ГСК, причем менее коммитированных и поэтому обладающих большим пролиферативным потенциалом, чем стволовые клетки костного мозга. Однако, несмотря на то что желточный мешок содержит полипотентные кроветворные клетки-предшественники, длительное время поддерживающие различные линии кроветворной дифференцировки in vitro, единственным критерием полноценности ГСК является их способность к продолжительной репопуляции органов гемопоэза реципиента, кроветворные клетки которого разрушены или генетически дефектны. Таким образом, ключевой вопрос состоит в том, могут ли полипотентные кроветворные клетки желточного мешка мигрировать и заселять кроветворные органы и целесоорбразно ли пересматривать известные работы, в которых продемонстрированы их возможности репопуляции кроветворных органов половозрелых животных с образованием основных гемопоэтических линий. У эмбрионов птиц еще в 70-е годы были выявлены интраэмбриональные источники дефинитивных ГСК, что уже тогда поставило под сомнение устоявшиеся представления об экстраэмбриональном происхождении ГСК, в том числе и у представителей других классов позвоночных. В последние несколько лет появились публикации о наличии у млекопитающих и человека подобных интраэмбриональных участков, содержащих ГСК.

Еще раз отметим, что фундаментальные знания в этой области крайне важны для практической клеточной трансплантологии, поскольку помогут не только определить предпочтительный источник ГСК, но и установить особенности взаимодействия первичных кроветворных клеток с генетически чужеродным организмом. Известно, что введение стволовых кроветворных клеток фетальной печени человека в зародыш овцы на стадии органогенеза приводит к рождению животных-химер, в крови и костном мозге которых стабильно определяются от 3 до 5% гемопоэтических клеток человека. При этом ГСК человека не изменяют свой кариотип, сохраняя высокий темп пролиферации и способность к дифференцировке. Кроме того, трансплантированные ксеногенные ГСК не конфликтуют с иммунной системой и фагоцитами организма-хозяина и не трансформируются в опухолевые клетки, что и легло в основу интенсивной разработки способов внутриутробной коррекции наследственной генетической патологии с помощью ГСК или ЭСК, трансфицированных дефицитными генами.

Но на каком этапе эмбриогенеза целесообразнее проводить такую коррекцию? Впервые клетки, детерминированные к гемопоэзу, появляются у млекопитающих непосредственно после имплантации (6-е сутки гестации), когда морфологические признаки кроветворной дифференцировки и презумптивные кроветворные органы еще отсутствуют. На этой стадии диспергированные клетки зародыша мыши способны репопулировать кроветворные органы облученных реципиентов с образованием эритроцитов и лимфоцитов, отличающихся от клеток хозяина соответственно типом гемоглобина или глицерофосфатизомеразы, а также дополнительным хромосомным маркером (Тб) донорских клеток. У млекопитающих, как и у птиц, одновременно с желточным мешком до замыкания общего сосудистого русла непосредственно в теле зародыша в парааортальной спланхноплевре появляются кроветворные клетки. Из AGM-района выделены кроветворные клетки фенотипа АА4.1+, охарактеризованные как мультипотентные кроветворные клетки, образующие Т- и В-лимфоциты, гранулоциты, мегакариоциты и макрофаги. Фенотипически эти мультипотентные клетки-предшественники весьма близки к ГСК костного мозга взрослых животных (CD34+c-kit+). Численность мультипотентных АА4.1+-клеток среди всех клеток AGM-района невелика - они составляют не более 1/12 его части .

У зародыша человека также выявлена гомологичная AGM-региону животных интраэмбриональная область, содержащая ГСК. Причем у человека более 80% мультипотентных клеток с высоким пролиферативным потенциалом содержится в теле зародыша, хотя такие клетки имеются и в желточном мешке. Детальный анализ их локализации показал, что сотни таких клеток собраны в компактные группы, которые располагаются в непосредственной близости к эндотелию вентральной стенки дорзальной аорты. Фенотипически они представляют собой CD34CD45+Lin -клетки. Напротив, в желточном мешке, а также в других кроветворных органах эмбриона (печень, костный мозг) такие клетки единичны.

Следовательно, у зародыша человека AGM-район содержит кластеры кроветворных клеток, тесно ассоциированные с вентральным эндотелием дорзальной аорты. Этот контакт прослеживается и на иммунохимическом уровне - и клетки кроветворных кластеров, и эндотелиоциты экспрессируют фактор роста эндотелия сосудов, Flt-3-лиганд, их рецепторы FLK-1 и STK-1, а также транскрипционный фактор стволовых клеток лейкемии. В AGM-районе мезенхимальные производные представлены плотным тяжем округлых клеток, расположенных вдоль всей дорзальной аорты и экспрессирующих тенасцин С - гликопротеид основного вещества, активно участвующий в процессах межклеточного взаимодействия и миграции.

Мультипотентные стволовые клетки AGM-района после трансплантации быстро восстанавливают кроветворение у половозрелых облученных мышей и длительно (до 8 месяцев) обеспечивают эффективный гемопоэз. В желточном мешке клеток с такими свойствами авторы не выявили. Результаты этого исследования подтверждаются данными другой работы, в которой показано, что у зародышей ранних стадий развития (10,5 суток) область AGM является единственным источником клеток, которые соответствуют определению ГСК, восстанавливая миелоидное и лимфоидное кроветворение у половозрелых облученных реципиентов.

Из AGM-района выделена стромальная линия AGM-S3, клетки которой поддерживают генерацию в культуре коммитированных клеток-предшественников CFU-GM, BFU-E, CFU-E и колониеобразующих единиц смешанного типа. Содержание последних при культивировании на фидерном подслое клеток линии AGM-S3 увеличивается от 10 до 80 раз. Таким образом, в микроокружении AGM-района присутствуют клетки стромальной основы, эффективно поддерживающие кроветворение, поэтому сам AGM-район вполне может выступать зародышевым кроветворным органом - источником дефинитивных ГСК, то есть, ГСК, формирующих кроветворную ткань взрослого животного.

Расширенное иммунофенотипирование клеточного состава AGM-района показало, что в нем пребывают не только мультипотентные кроветворные клетки, но и клетки, коммитированные к миелоидной и лимфоидной (Т- и В-лимфоциты) дифференцировке. Однако при молекулярном анализе отдельных CD34+c-kit+ клеток из AGM-района с помощью полимеразной цепной реакции выявлено активирование только бета-глобинового и миелопероксидазного, но не лимфоидных генов, кодирующих синтез CD34, Thy-1 и 15. Частичное активирование линиеспецифических генов характерно для ранних онтогенетических этапов генерации ГСК и клеток-предшественников. Учитывая, что количество коммити- рованных клеток-предшественников в AGM-районе 10-суточного зародыша на 2-3 порядка ниже, чем в печени, можно утверждать, что на 10-е сутки эмбриогенеза гемопоэз в области AGM только начинается, тогда как в основном кроветворном органе плода в этот период гемопоэтические линии уже развернуты.

Действительно, в отличие от более ранних (9-11-е сутки) гемопоэтических стволовых клеток желточного мешка и области AGM, которые репопулируют кроветворное микроокружение новорожденного, но не взрослого организма, кроветворные клетки-предшественники 12-17-суточной эмбриональной печени уже не нуждаются в раннем постнатальном микроокружении и заселяют органы кроветворения взрослого животного не хуже, чем новорожденного. После трансплантации ГСК эмбриональной печени гемопоэз у облученных взрослых мышей-реципиентов имел поликлональный характер. Кроме того, с помощью меченых колоний показано, что функционирование прижившихся клонов полностью подчиняется клональной сукцессии, выявленной во взрослом костном мозге. Следовательно, ГСК эмбриональной печени, маркированные в максимально щадящих условиях, без престимуляции экзогенными цитокинами, уже обладают основными атрибутами взрослых ГСК: не нуждаются в раннем постэмбриональном микроокружении, переходят в состояние глубокого покоя после трансплантации и мобилизуются в клонообразование последовательно в соответствии с моделью клональной сукцессии.

Очевидно, следует несколько подробнее остановиться на феномене клональной сукцессии. Эритропоэз осуществляют стволовые кроветворные клетки, обладающие высоким пролиферативным потенциалом и способностью к дифференцировке во все линии коммитированных клеток-предшественников форменных элементов крови. При нормальной интенсивности кроветворения большая часть гемопоэтических стволовых клеток пребывает в дормантном состоянии и мобилизуется к пролиферации и дифференцировке, последовательно образуя сменяющие друг друга клоны. Этот процесс и получил название клональной сукцессии. Экспериментальное доказательство клональной сукцессии в кроветворной системе было получено в исследованиях с ГСК, маркированных ретровирусным переносом гена. У взрослых животных кроветворение поддерживается многими, одновременно функционирующими кроветворными клонами, производными ГСК. На основании феномена клональной сукцессии разработан репопуляционный подход к идентификации ГСК. По этому принципу различают долговременную ГСК (long-term haematopoietic stem cell, LT-HSC), способную восстанавливать кроветворную систему на протяжении всей жизни, и кратковременную ГСК, выполняющую эту функцию в течение ограниченного периода времени.

Если рассматривать гемопоэтические стволовые клетки с точки зрения репопуляционного подхода, то особенностью гемопоэтических клеток эмбриональной печени является их способность создавать колонии, которые по размеру значительно превышают таковые при росте ГСК кордовой крови или костного мозга, причем это относится ко всем типам колоний. Уже этот факт указывает на более высокий пролиферативный потенциал кроветворных клеток эмбриональной печени. Уникальное свойство гемопоэтических клеток-предшественников эмбриональной печени - более короткий по сравнению с другими источниками клеточный цикл, что имеет большое значение с точки зрения эффективности репопуляции органов кроветворения при трансплантации. Анализ клеточного состава гемопоэтической суспензии, полученной из источников зрелого организма, свидетельствует о том, что на всех стадиях онтогенеза ядерные клетки преимущественно представлены окончательно дифференцированными клетками, количество и фенотип которых зависят от онтогенетического возраста донора кроветворной ткани. В частности, суспензии мононуклеарных клеток костного мозга и кордовой крови более чем на 50% состоят из зрелых клеток лимфоидного ряда, тогда как в гемопоэтической ткани эмбриональной печени содержится менее 10% лимфоцитов. Кроме того, клетки миелоидной линии в эмбриональной и фетальной печени представлены преимущественно эритроидным рядом, в то время как в кордовой крови и костном мозге превалируют гранулоцитарно-макрофагальные элементы.

Немаловажным является и тот факт, что эмбриональная печень содержит полный набор наиболее ранних предшественников гемопоэза. Среди последних следует отметить эритроидные, гранулопоэтические, мегакариопоэтические и мультилинейные колониеобразующие клетки. Их более примитивные предшественники - LTC-IC - способны пролиферировать и дифференцироваться in vitro в течение 5 и более недель, а также сохранять функциональную активность после приживления в организме реципиента при аллогенной и даже ксеногенной трансплантации иммунодефицитным животным.

Биологическая целесообразность преобладания в эмбриональной печени клеток эритроидного ряда (до 90% общего количества кроветворных элементов) обусловлена необходимостью обеспечения эритроцитарной массой быстро возрастающего объема крови развивающегося плода. В эмбриональной печени эритропоэз представлен ядерными эритроидными предшественниками различной степени зрелости, содержащими фетальный гемоглобин (а2у7), который благодаря более высокому сродству к кислороду обеспечивает эффективную абсорбцию последнего из материнской крови. Интенсификация эритропоэза в эмбриональной печени ассоциируется с локальным повышением синтеза эритропоэтина (ЕРО). Примечательно, что для реализации гемопоэтического потенциала кроветворных клеток эмбриональной печени достаточно присутствия одного только эритропоэтина, тогда как для коммитирования к эритропоэзу ГСК костного мозга и кордовой крови требуется комбинация цитокинов и факторов роста, состоящая из ЕРО, SCF, GM-CSF и IL-3. При этом ранние клетки-предшественники гемопоэза, выделенные из эмбриональной печени, не имеющие рецепторов к ЕРО, не отвечают на экзогенный эритропоэтин. Для индукции эритропоэза в суспензии мононуклеарных клеток эмбриональной печени необходимо присутствие более продвинутых эритропоэтинчувствительных клеток с фенотипом CD34+CD38+, которые экспрессируют ЕРО-рецептор.

В литературе до сих пор не сложилось единого мнения о становлении гемопоэза в эмбриональном периоде. Не установлено и функциональное значение существования экстра- и интраэмбриональных источников клеток-предшественников кроветворения. Однако не вызывает сомнений, что в эмбриогенезе человека печень является центральным органом гемопоэза и на 6-12-й неделях гестации служит основным источником стволовых кроветворных клеток, которые заселяют селезенку, тимус и костный мозг, ГДР обеспечивают выполнение соответствующих функций в пре- и постнатальном периодах развития.

Следует еще раз отметить, что эмбриональная печень по сравнению с другими источниками характеризуется самым высоким содержанием ГСК. Примерно 30% CD344-клеток эмбриональной печени имеет фенотип CD38. В то же время количество лимфоидных клеток-предшественников (CD45+) на ранних сроках кроветворения в печени составляет не более 4%. При этом установлено, что, по мере развития плода, от 7 до 17 недель гестации количество В-лимфоцитов прогрессивно возрастает с ежемесячным “шагом”, составляющим 1,1%, тогда как уровень ГСК перманентно снижается.

Функциональная активность гемопоэтических стволовых клеток также зависит от срока эмбрионального развития их источника. Исследование колониеобразующей активности клеток печени эмбрионов человека 6-8-й и 9-12-й недель гестации при культивировании в полужидкой среде в присутствии SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 и ЕРО показало, что общее число колоний в 1,5 раза выше при посеве ГСК эмбриональной печени ранних сроков развития. В то же время количество в печени таких клеток-предшественников миелопоэза, как CFU-GEMM, на 6-8-й неделях эмбриогенеза более чем в три раза превышает их число на 9-12-й неделях гестации. В целом, колониеобразующая активность гемопоэтических клеток печени эмбрионов первого триместра гестации оказалась значительно выше, чем клеток фетальной печени второго триместра беременности.

Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что эмбриональная печень в начале эмбриогенеза отличается не просто повышенным содержанием ранних клеток-предшественников гемопоэза, но ее гемопоэтические клетки характеризуются более широким спектром дифференцировки в различные клеточные линии. Эти особенности функциональной активности стволовых гемопоэтических клеток эмбриональной печени могут иметь определенное клиническое значение, поскольку их качественные характеристики позволяют ожидать выраженного терапевтического эффекта при трансплантации даже небольшого количества клеток, полученных на ранних сроках гестации.

Тем не менее, проблема количества гемопоэтических стволовых клеток, необходимого для эффективной трансплантации, остается открытой и актуальной. Предпринимаются попытки решить ее, используя высокий потенциал самовоспроизводства кроветворных клеток эмбриональной печени in vitro при их стимуляции цитокинами и факторами роста. При постоянной перфузии в биореакторе ранних ГСК эмбриональной печени через 2-3 дня на выходе удается получить количество стволовых кроветворных клеток, в 15 раз превышающее их исходный уровень. Для сравнения следует заметить, что для достижения 20-кратного повышения выхода ГСК кордовой крови человека в тех же условиях требуется не менее двух недель.

Таким образом, эмбриональная печень отличается от других источников гемопоэтических стволовых клеток более высоким содержанием как коммитированных, так и ранних клеток-предшественников кроветворения. В культуре с факторами роста клетки эмбриональной печени с фенотипом CD34+CD45Ra1 CD71l0W образуют в 30 раз больше колоний, чем аналогичные клетки кордовой крови, и в 90 раз больше, чем ГСК костного мозга. Наиболее выражены в указанных источниках различия в содержании ранних клеток-предшественников гемопоэза, образующих смешанные колонии - количество CFU-GEMM в эмбриональной печени превышает таковое в кордовой крови и костном мозге соответственно в 60 и 250 раз.

Немаловажным является и тот факт, что вплоть до 18-й недели эмбрионального развития (период начала гемопоэза в костном мозге) в реализацию функции кроветворения вовлечено более 60% клеток печени. Поскольку до 13-й недели развития у плода человека отсутствуют тимус и соответственно тимоциты, трансплантация гемопоэтических клеток эмбриональной печени 6-12-недельной гестации значительно снижает риск развития реакции “трансплантат против хозяина” и не требует подбора гистосовместимого донора, так как позволяет относительно легко добиться гемопоэтического химеризма.